تنش خشکی زمانی در گیاه حادث میشود که میزان آب دریافتی گیاه کمتر از تلفات آن باشد. این امر ممکن است به علت اتلاف بیشازحد آب یا کاهش جذب و یا وجود هر دو مورد باشد (کوچکی،۱۳۷۴). یکی از نشانههای کمبود آب، کاهش تورژسانس و درنتیجه رشد و توسعه سلول بهویژه در ساقه و برگها است. به همین دلیل اولین اثر محسوس کمآبی را میتوان از اندازه کوچکتر برگها یا ارتفاع گیاهان تشخیص داد. به دنبال کاهش سطح برگ، جذب نور نیز کم شده و باعث کاهش ظرفیت کل فتوسنتزی گیاه شده و رشد و درنهایت عملکرد آن دچار نقصان میشود (حسنی، ۱۳۸۵). خشکی بر جنبههای مختلف رشد گیاه تاثیر گذاشته و موجب کاهش و به تأخیر انداختن جوانهزنی، کاهش رشد اندامهای هوایی کاهش تولید ماده خشک میگردد. درصورتیکه شدت تنش خشکی زیاد باشد، موجب کاهش شدید فتوسنتز، مختل شدن فرآیندهای فیزیولوژیکی، توقف رشد و سرانجام مرگ گیاه میشود (سینگ و همکاران، ۱۹۹۶). کمبود آب از مهمترین مشکلات مناطق خشک و نیمه خشک میباشد که بر روی رشد و نمو گیاهان اثر میگذارد (اهدایی، ۱۳۷۲). نواحی خشک و نیمه خشک مناطقی هستند که کل تعرق گیاهان در آن ۵۰% تعرق در شرایط بدون تنش ویا حتی کمتر از این مقدار باشد. متأسفانه کمبود آب تنها منحصر به این نواحی نمیشود، بلکه حتی در شرایط آبوهوای مرطوب و یا توزیع نامنظم بارندگی نیز منجر به محدود شدن آب قابل دسترس و درنتیجه کاهش رشد گیاه میشود (کافی، ۱۳۸۴). در کشور ما بهجز سواحل دریای خزر و قسمتهای کوچکی از شمال غربی کشور بقیه مناطق جزء مناطق خشک و نیمه خشک محسوب میشوند. این در حالی است که مناطق خشک کشور نسبت به مناطق نیمه خشک آن از وسعت بیشتری برخوردار است (اهدایی، ۱۳۷۲).
۱-۲-۳ لزوم معرفی گیاهان متحمل به خشکی
۵/۹۷ درصد آبکره زمین در دریاها و دریاچهها است که آبشور را تشکیل میدهد. ۵/۲ درصد باقیمانده آب شیرینی است که در زمین وجود دارد که از آن ۳/۰ درصد آب رودخانهها ۸/۳۰ درصد آبهای زیرزمینی و ۹/۶۸ درصد یخچالها و پوشش دائمی برف کوهها است. کشور ایران به خاطر قرار گرفتن در کمربند خشک جغرافیایی و نوار بیابانی که در ۲۵ تا ۴۰ درجه عرض شمالی واقعشده است، از شرایط آبوهوایی برخوردار است که جزو مناطق کم باران جهان بشمار میآید. باوجود قرارگرفتن کشور ایران در کمربند خشک جهانی تغییرپذیری شدید اقلیمی، بارش تنها معادل یکسوم متوسط جهانی میباشد (حیدری شریفآباد و همکاران،۱۳۸۱). بر اساس گزارشها در سال ۱۳۸۰ حدود ۲/۶ میلیون هکتار زراعت آبی و ۴ میلیون هکتار زراعت دیم و ۱/۱ میلیون هکتار از باغات تحت تاثیرداشته خشکسالی قرار گرفتهاند. خسارت ناشی از خشکسالی بر باغات در این سال بالغبر ۵۲۰ میلیون دلار بود. بر اساس تحقیقات انجامگرفته در کشور، اثر مستقیم خسارت ناشی از کاهش هر ۱ میلیمتر بارندگی برابر ۹۸ میلیارد ریال است (غفاری،۱۳۸۶). ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﺑﻴﺶ از ﻫﺮ ﻋﺎﻣﻞ دﻳﮕﺮی ﻣﻮﺟﺐ ﻛﺎﻫﺶ رﺷﺪ و ﺗﻮﻟﻴﺪ ﮔﻴﺎﻫﺎن میگردد. ﺑﻬﺘﺮﻳﻦ راه ﻣﻘﺎﺑﻠﻪ ﺑﺎ ﺧﺸﻜﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺑﻬﻴﻨﻪ از آب و اﺻﻼح ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺑﺮای اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ اﺳﺖ. ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ، ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﮔﻴﺎه ﺑﺮای رﺷﺪ ﻣﻄﻠﻮب در ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ است.
۱-۲-۴ کاهش رشد گیاه تحت تنش خشکی
ﺑﻴﺶ از ۸۰ درﺻﺪ ﺑﺎﻓﺖ ﮔﻴﺎﻫﻲ را آب ﺗﺸﻜﻴﻞ میدهد (مارشال، ۱۹۸۶) و ﻛﻤﺒﻮد آن در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻋﻮارض ﺷﺪﻳﺪی را بهسرعت آﺷﻜﺎر میسازد و مهمترین ﻋﺎﻣﻞ ﻣﺤﺪودﻛﻨﻨﺪه رﺷد و ﻧﻤﻮ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻣﺤﺴﻮب میشود. ﺑﺮای اﻳﻨﻜـﻪ ﮔﻴـﺎه ﺑﺘﻮاﻧـﺪ آب ﺟﺬب ﻛﻨﺪ، ﺑﺎﻳﺴﺘﻲ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب سلولهای رﻳﺸﻪ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ اﻃـﺮاف آن ﻛﻤﺘـﺮ ﺑﺎﺷـﺪ (هوگنبوم، ۱۹۸۷). درواقع در ﺷـﺮاﻳﻂ ﺗـﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب ﻣﺤﻴﻂ ﮔﻴﺎه منفیتر از ﺷﺮاﻳﻂ ﻃﺒﻴﻌﻲ ﺑﻮده و ﺟﺬب آب ﺗﻮﺳﻂ ﮔﻴﺎه ﺑﺎ ﻣﺸﻜﻞ ﻣﻮاﺟﻪ میشود. ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت ﺑﺴﻴﺎری در ﻣﻮرد ﺗﺄﺛﻴﺮ ﻛﻤﺒﻮد آب ﺑﺮ رﺷﺪ و ﻧﻤﻮ ﮔﻴﺎﻫﺎن انجامشده اﺳـﺖ اﻳـﻦ ﺗﺤﻘﻴﻘـﺎت ﺣـﺎﻛﻲ از آن اﺳﺖ ﻛﻪ ﻛﺎﻫﺶ رﺷﺪ ﺑﻪ دﻻﻳﻞ ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ ﺣﺎدث میشود. وﻗﺘﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺑﻪ آب ﻛﺎﻓﻲ دﺳﺘﺮﺳﻲ ﻧﺪاﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﻨﺪ، ﻣﻘﺪار مواد ﺑﺎزدارﻧﺪه رﺷﺪ ازجمله آﺑﺴﻴﺰﻳﻚ اﺳﻴﺪ، در ﮔﻴﺎه اﻓـﺰاﻳﺶ مییابد. از ﻃﺮﻓـﻲ ﺑﺮﺧـﻲ از ﻣﺤﻘﻘـﺎن ﻛـﺎﻫﺶ ﻣﻘـﺪار هورمونهای ﻣﺤﺮک رﺷﺪ ﻣﺎﻧﻨﺪ اکسینها، جیبرلینها ﺳﻴﺘﻮﻛﻴﻨﻴﻦﻫﺎ در ﮔﻴﺎه را براثر ﻛﻤﺒﻮد آب ﮔـﺰارش کردهاند (فهیمی،۱۹۹۶). در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻧﺨﺴﺘﻴﻦ آﺛﺎر ﻛﻤﺒﻮد آب بهصورت ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن روزنهها ﺑﺮوز میکند. ازآنجاییکه ﺑـﺮای اﻧﺠـﺎم ﻋﻤـﻞ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﺗﺒﺎدﻻت ﮔﺎزی ﺿﺮوری اﺳﺖ، ﺑﻨﺎﺑﺮاﻳﻦ، در اﺛﺮ ﻛﻤﺒﻮد آب و ﺑﺴﺘﻪ ﺷﺪن روزنهها ﺗﺒﺎدﻻت ﮔﺎزی کاهشیافته و درنتیجه کربن مونواکسید ﻛﻤﺘﺮی در دﺳﺘﺮس ﮔﻴﺎه ﻗﺮار میگیرد و شدت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﻛﺎﻫﺶ مییابد (مارتین و رزای،۱۹۹۲). ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ از ﻃﺮﻳﻖ ﻋﻮاﻣﻞ ﻏﻴﺮ روزنهای ﻧﻴﺰ ﺑﺮ ﺷﺪت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ تاثیر میگذارد. ﺑﻄﻮرﻳﻜﻪ واکنشهای ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ همچنین دﺳﺘﮕﺎه ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰی در اثر ﻛﻤﺒﻮد آب آسیبدیده و درنتیجه ﺷﺪت ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﻛﺎﻫﺶ مییابد. ﻋﻼوه ﺑـﺮ اﻳـﻦ در ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ ﺳﻄﺢ ﺑﺮگ ﻧﻴﺰ کاهشیافته و اﻳﻦ امر نیز ﺑﺎﻋﺚ ﻛﺎﻫﺶ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ ﺧـﺎﻟﺺ میشود (استراک، ۱۹۸۱). تنش خشکی با کاهش سطح برگ، انسداد روزنهها، کاهش فعالیتهای پروتوپلاسمی و تثبیت گازکربنیک، کاهش سنتز پروتئین و کلروفیل سبب تقلیل فرایند فتوسنتز میگردد (امام، ۱۳۸۳).
جانسون و هرتز ثابت کرده اند که پتانسیل آب برگ میزان فتوسنتز را مستقیماً تحت تاثیر قرار میدهد. با افزایش تنش آب فتوسنتز تا نقطه فتوسنتز کاهش مییابد و بهطور مستقیم بر فرایندهای بیوشیمیایی مربوط به فتوسنتز اثر گذاشته و بهطور غیرمستقیم ورود گازکربنیک به داخل روزنهها را که به علت تنش آب مسدود باشند را کاهش میدهد (فائو، ۲۰۰۵).
شرایط تنش شدید تنفس، جذب گازکربنیک، انتقال مواد فتوسنتزی و انتقال مواد خام در آوندهای چوبی به حد بسیار کم نزول کرده و این در حالی است که فعالیت آنزیمهای هیدرولیز کننده افزایش مییابد، کاهش مواد فتوسنتزی موجب اشباع برگها از این مواد میگردد. درنهایت کاهش فتوسنتز را در پی خواهد داشت (کوچکی،۱۳۶۵).
بویر با تشریح فیزیولوژیکی غلات تحت تنش اظهار داشته تنش رطوبتی موجب کاهش فتوسنتز، پیری زودرس و ریزش برگهای پایین گیاه میگردد (بویر، ۱۹۹۵). در شرایط تنش کاهش ماده خشک میتواند به دلیل فشار آماس سلول ناشی از کاهش سطح برگ گیاه همچنین کاهش نرخ فتوسنتزی به دلیل محدودیتهای بیوشیمیایی ناشی از کمبود آب از قبیل کاهش رنگدانههای فتوسنتزی به خصوص کلروفیل ها باشد (لاولر،۲۰۰۲).
۱-۲-۵ تنش خشکی و اختلال در فعالیت گیاه
تغییرات فیزیولوژیکی که در اثر کمبود آب در گیاه ایجاد میشود، صدمات اکسیداتیو نیز از عوامل مهم محدودکننده رشد و تولیدات گیاهی هستند که در اثر عدم وجود شرایط مناسب ایجاد میشود. بیشترین صدمه در گیاهان صدمه اکسیداتیو در سطح سلول است (آلن،۱۹۹۵). آلن گزارش کرده است که بیشترین خسارت در گیاهان که از طریق تنشهای مختلف اعمال میشود، در ارتباط با خسارت اکسیداتیو در سطوح مختلف سلولی است. ارگانیزمهای فتوسنتز کننده هوازی در طول دوره زندگی در معرض میزان متفاوتی از سمومی هستند که این سمیت در گیاهان عالی از کمبود آب حادتر است (سایرام وهمکاران، ۲۰۰۱). نتایج مطالعات نشان میدهد در شرایط تنش و حتی تحت غلظتهای بالای CO2 محیطی، بازهم فتوسنتز کاهش مییابد که بیانکننده این امر است که دستگاه فتوسنتز صرفنظر از بسته شدن روزنهها، تحت تاثیر قرارگرفته است. در شرایط تنش کمبود آب روزنهها در گیاه بسته میشوند و متعاقب آن غلظت CO2 در بافت مزوفیل کاهش مییابد و به دنبال این وضعیت واکنشهای تاریکی فتوسنتز مختل شده و محصولات حاصل از واکنشهای روشنایی که شامل ATP، NADPH است، مصرف نمیشود. در چنین شرایطی به دلیل عدم اکسید شدن مولکول NADPH، مصرف NADP+ جهت دریافت الکترون کاهش مییابد، بنابراین مولکول اکسیژن در مسیر زنجیره انتقال الکترون بهعنوان پذیرنده جانشین الکترون عمل میکند و منجر به شکلگیری رادیکال سوپر اکسید (O2-)، پر اکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدروکسید (OH-) میگردد (سایرام و همکاران،۲۰۰۰؛تارکان،۲۰۰۵). فعالیت گونههای فعال اکسیژن[۳] (ROS) ممکن است سبب بروز صدماتی همچون اکسید شدن لیپیدها، (درنتیجه منجر به تغییر ساختار غشاء و درنتیجه ازهمپاشیدگی یکپارچگی آن میشود)، تغییر ساختمان پروتئینها و اکسید شدن گروههای سولفیدریل (-SH)، غیرفعال شدن آنزیمها، بیرنگ شدن و یا از بین رفتن رنگدانه هادی مانند کلروفیل و سایر ترکیبات رنگیزهای و همچنین حمله مداوم به مولکولهای آلی مثل DNA و درنتیجه اختلال در رشتههای DNA گردد(حبیبی و همکاران، ۲۰۰۴؛ موهنتی، ۲۰۰۳؛ میتلر و همکاران، ۲۰۰۲).
۱-۲-۶ مکانیسمهای مقاومت به خشکی در گیاهان
گیاهان دارای مکانیزم های مختلفی برای مواجه با تنش میباشند. ﻓﺮار از ﺧﺸﻜﻲ یکی از مکانیم هاست ﻛﻪ ﮔﻴﺎه ﺗﻼش میکند ﺑﺎ رﺷﺪ ﺳﺮﻳﻊ و کوتاهمدت ﺧﻮد ﻗﺒﻞ از ﺗﺨﻠﻴﻪ رﻃﻮﺑﺖ ﺧﺎک ﺑﺬرﺗﻮﻟﻴﺪ ﻛﻨﺪ. ﺗﺤﻤﻞ ﺑﻪ ﺧﺸﻜﻲ مکانیزم دیگری است که ﺗﻮﺳﻂ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی، اﻓﺰاﻳﺶ ﻗﺎﺑﻠﻴﺖ ارﺗﺠﺎع، ﻛﺎﻫﺶ اﻧﺪازه ﺳﻠﻮل و آب ﻛﺸﻴﺪﮔﻲ از ﻃﺮﻳﻖ ﺗﺤﻤﻞ ﭘﺮوﺗﻮﭘﻼﺳﻤﻲ و ﺗﻐﻴﻴﺮ در ﺧﺼﻮﺻﻴﺎت دﻳﻮاره ﺳﻠﻮﻟﻲ از روشهای ﺗﺤﻤﻞ ﮔﻴﺎه به شمارمی رود. (نیلسون و ارکوت، ۱۹۹۶؛ کوچکی و همکاران، ۱۳۷۲) ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی با ﻛﺎﻫﺶ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰی ﺑﻪ ﻋﻠﺖ ﺗﺠﻤﻊ ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه در ﭘﺎﺳﺦ ﺑﻪ ﻛﻤﺒﻮد آب ایجاد میشود. ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰی در داﺧﻞ ﺳﻠﻮل ﺑﺎ اﺿﺎﻓﻪ ﻳﺎ ﺣﺬف ﻛﺮدن ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه از ﺳﻠﻮل انجام می شود ﺗﺎ زﻣﺎﻧﻲ ﻛﻪ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ اﺳﻤﺰی درون ﺳﻠﻮل ﺑﺎ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ ﻣﺤﻴﻂ اﻃﺮاف ﺳﻠﻮل تقریبا ﺑﺮاﺑﺮ ﺷﻮد و اﻳﻦ ﻣﻮرد اﻏﻠﺐ ﺑﺮای ﮔﻴﺎﻫﺎن ﭘﺴﺖ ﺑﻜﺎر میرود. ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ آب ﻛﻞ میتواند در ﻫﻨﮕﺎم بروز ﺧﺸﻜﻲ ﺗﻮﺳﻂ تنظیم اﺳﻤﺰی ﺑﺎ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻴﺰان پتانسیل آب ﺳﻠﻮل و ﻳﺎ افزایش مواد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه و با دﺧﺎﻟﺖ ﻗﻨﺪﻫﺎ ﺗﻨﻈﻴﻢ ﮔﺮدد و ﺑﺴﺘﻪ ﺑﻪ ﮔﻮﻧﻪ ﮔﻴﺎﻫﻲ، اسمولیتها اﺻﻠﻲ و ﻛﻠﻴﺪی در ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی ﻣﺘﻔﺎوت اﺳﺖ. ﺑﺮای ﻣﻮاد ﺗﺠﻤﻊ ﻳﺎﻓﺘﻪ اﺛﺮات ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ گزارششده اﺳﺖ. اﻳﻦ ﻣﻮاد میتوانند ﺑﺎ اﻓﺰاﻳﺶ ﻧﮕﻬﺪاری آب و ﺣﻔﻆ ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ تورگر ﺳﺒﺐ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی ﺷﻮﻧﺪ. در ﺗﻌﺪادی از واکنشهای ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﺟﺎﻧﺸﻴﻦ آبگردند و ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ ﺑﺎ ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ ﭘﻴﻮﻧﺪ داده و از ﺗﺨﺮﻳﺐ ﻏﺸﺎء جلوگیری نمایند و ﻳﺎ از ﺗﻔﻜﻴﻚ کمپلکسهای ﭘﺮوﺗﺌﻴﻨﻲ و ﻳﺎ غیرفعال ﺷﺪه آنزیمها ﺟﻠﻮﮔﻴﺮی ﻛﻨﻨﺪ (زانگ و همکاران،۱۹۹۶).
در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ ﺧﺸﻜﻲ واﻛﻨﺶ ﻋﻤﻮﻣﻲ ﺗﺠﻤﻊ ﻣﻮاد ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه ﺳﺎزﮔﺎر ﺻﻮرت میگیرد ﻛﻪ ﺑﺴﻴﺎری از آنها اﺳﻤﻮﻟﻴﺘﻬﺎ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﻨﻈﻴﻢ اﺳﻤﺰی میشود. ﺗﺠﻤﻊ و ﻧﻮع ﻣﺎده ﺣﻞ ﺷﻮﻧﺪه در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺳﺎزﮔﺎری در گونههای ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﺘﻔﺎوت اﺳﺖ ﻛﻪ ﺷﺎﻣﻞ آﻣﻴﻨﻮاﺳﻴﺪﻫﺎ (پرولین), ﻗﻨﺪﻫﺎ (ساکارز، فروکتان) ﭘﻠﻲ مرها (مانیتور، سوربیتول) اسیدآمینه (ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ، ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ) یونها (ﭘﺘﺎﺳﻴﻢ)، اﺳﻴﺪﻫﺎی آﻟﻲ (مالت و ﻧﻴﺘﺮات) میباشند؛ مثل ﺗﺠﻤﻊ ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ اﺳﻤﺰی ﺧﺼﻮﺻﻴﺖ ﺑﺎرز در ﺧﺎﻧﻮاده Plumbaginaceae است درحالیکه در ﺗﻨﺒﺎﻛﻮ و ﺑﺮﻧﺞ ﺳﻴﺮ ﺑﻴﻮﺳﻨﺘﺰی ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ بتائین دیده ﻧﺸﺪه اﺳﺖ (صفر نژاد، ۱۹۹۶؛رونتین همکاران، ۲۰۰۲). ﻛﻤﺒﻮد آب ﺳﺒﺐ ﺑﻴﺎن ژنهای ﺧﺎص میشود و ﺑﻴﺎن اﻳﻦ ژنها ﺑﺎ پاسخهای ﺳﺎزﮔﺎری ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺤﺖ تنش در ارﺗﺒﺎط اﺳﺖ (شین واری،۲۰۰۰). ﺗﻨﺶ آب ﺑﻪ ﺳﺒﺐ ﺗﻐﻴﻴﺮات ﺑﻴﺎن ژنها در ﮔﻴﺎﻫﺎن بهرغم ﻛﺎﻫﺶ ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ ﻛﻞ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﻮﻟﻴﺪ پروتئینهای ویژهای میگردد ﻛﻪ سلولها و بهطورکلی ﮔﻴﺎه را در برابر تنش ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ میکنند (صفرنژاد،۱۹۹۶). اﻳﻦ پروتئینها ﺷﺎﻣﻞ چاپرونها، LEAs (Late embryogenesis, abundant) اﺳﻤﻮﺗﻴﻦ و پروتئینهای ﺿﺪ ﻳﺨﺰدﮔﻲ، پروتئینهای متصل به mRNA و آنزیمهای ﻛﻠﻴﺪی ﺑﺮای بیوسنتزی اﺳﻤﻮﻟﻴﺘﻬﺎ، پروتئینهای ﻛﺎﻧﺎل آب، ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ پرولین و ﻗﻨﺪﻫﺎ و آنزیمهای سمزدا میباشند. پروتئینهای LEA،پروتئینهای ﻣﺘﺼﻞ ﺑﻪ mRNA و چاپرونها در ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ماکرو مولکولهایی ﻫﻤﭽﻮن آنزیمها، ﻟﻴﭙﻴﺪﻫﺎ و mRNA در ﺑﺮاﺑﺮ دﻫﻴﺪراﺳﻴﻮن دﺧﺎﻟﺖ دارﻧﺪ. پرولین، ﮔﻼﻳﺴﻴﻦ ﺑﺘﺎﺋﻴﻦ و ﻗﻨﺪﻫﺎ بهعنوان اسمولیتها ﻋﻤﻞ ﻛﺮده و از سلولها در برابر دهیدراسیون ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ می کند. پروتئینهای ﻛﺎﻧﺎل آب، ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ ﻗﻨﺪﻫﺎ و ﻧﺎﻗﻠﻴﻦ پرولین در اﻧﺘﻘﺎل آب، ﻗﻨﺪﻫﺎ و پرولین ﺑﺎ ﻋﺒﻮر از ﻋﺮض ﻏﺸﺎﻫﺎی ﭘﻼﺳﻤﺎﻳﻲ و ﺗﻮﻧﻮﭘﻼﺳﺖ در ﺗﻨﻈﻴﻢ ﻓﺸﺎر اﺳﻤﺰی ﺗﺤﺖ ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﻨﺶ ﻋﻤﻞ میکنند. آنزیمهای سمزدا شامل سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR) میباشند در ﻣﺤﺎﻓﻈﺖ ﺳﻠﻮل در ﺑﺮاﺑﺮ اﻛﺴﻴﮋن ﻓﻌﺎل ﻋﻤﻞ میکند (یاماگیچی،۲۰۰۲). ﺗﻮﻟﻴﺪ پروتئینهای دﻳﮕﺮ ﻧﻴﺰ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ آب ﻫﻤﭽﻮن (responsive to ABA) RABs dehydrins و پروتئینهای ذﺧﻴﺮه روﻳﺸﻲ در ﮔﻴﺎﻫﺎن ﻣﺨﺘﻠﻒ گزارششدهاند (Artlip and Funkhouser,1995).
سیستم غیر آنزیمی که شامل آسکوربات، توکوفرول، کاروتنوئیدها و ترکیبات متفرقه (ازجمله فلاونوئیدها، مانیتورها و پلی فنها) نیز وجود دارد (بلوخین،۲۰۰۳). تعدد و کثرت سیستمهای دفاعی به این خاطر است که انواع اکسیژنهای واکنش زا (ROS) در سلولها تولید میشوند و همچنین در خاصیتهایی چون توانائی انتشار، حلالیت و تمایل به واکنش با مولکولهای بیولوژیک مختلف را دارند. بنابراین به مجموعهای بههمپیوسته از مولکولهای دفاعی برای عمل در هر دو مرحله آلی و غشائی در تمام بخشهای سلول برای غیرفعال کردن رادیکالها به همان سرعتی که آنها شکل میگیرند، نیاز است. تحقیقات مختلف نشان داده است که یک ارتباط قوی بین تحمل به تنشهای اکسیداتیو و افزایش غلظت آنزیمهای آنتیاکسیدان در گیاهان فتوسنتز کننده وجود دارد (سایرام، ۲۰۰۲). محققین نشان دادهاند که غلظت آنزیمهای آنتیاکسیدان در شرایط تنش دو برابر شده و لذا باعث افزایش مقاومت به تنشهای اکسیداتیو میشوند و از طرفی تنش خشکی نیز میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و سوپر اکسید دیسموتاز را افزایش میدهد (گامبل و همکاران،۱۹۸۴؛لاسکانو و همکاران ۲۰۰۵). اصغری و همکاران نیز با قرار دادن گیاهچههای دو رقم گندم در معرض تنش خشکی گزارش کردند که رقم مقاوم به تنش از فعالیت بالاتر آنزیم آسکوربات پراکسیداز در مقایسه با رقم حساس برخوردار بود (شری و همکاران، ۲۰۰۰). این محققین اظهار داشتند که تنش خشکی سبب کاهش بیشتر در مقدار آب نسبی (RWC) رقم حساس گردید.
۱-۲-۳ آنزیمها
آنزیمها کاتالیزورهای حیاتی و تمام پپتیدی یا پروتئینی هستند که توسط سلول زنده سنتز شده و عمل کاتالیز واکنشهای بیوشیمیایی را در داخل یا خارج سلول بر عهدهدارند. آنزیمها اختصاصیترین پروتئینهایی هستند که میتوان فعالیت آنها را بهصورت کاتالیز واکنشهای بیوشیمیایی نشان داد. این ترکیبات دارای ۲ خاصیت مهم هستند:
کاتالیز کردن واکنشهای بیوشیمیایی و افزایش سرعت این واکنشها.
عمل کردن اختصاصی بر روی پیش ماده، آنزیمها چنان اختصاصی عمل میکنند که میتوانند موادی را که دارای گردش نوری متفاوت هستند از یکدیگر بازشناخته و فقط بر روی ۱ نوع ایزومر نوری عمل کنند.
در ساختمان آنزیم محلی مخصوص، که به آن جایگاه فعال میگویند وجود دارد. این جایگاه و همچنین شکل و گروههای شیمیایی ساختار آنزیم موجب میگردند که یک آنزیم بهطور اختصاصی بر روی یک سوبسترا عمل کند. ازنظر ساختمانی آنزیمها را به دودسته تقسیم میکنند. تعدادی از آنزیمها فعالیتشان تنها به ساختمان پروتئینی بستگی دارد، درحالیکه برخی دیگر از آنزیمها برای انجام فعالیتهای کاتالیزوری خود به ترکیبات فعالکننده غیر پروتئینی (کوفاکتور) نیاز دارند. کوفاکتورها نیز بر دو نوع میباشند:
کوفاکتورهایی که تنها شامل یک یون فلزی مانند Zn++، Mg++، Mn++، Cu++، Fe++، Na+ و یا k+ میباشند. اینگونه کوفاکتورها به دو صورت عمل میکنند.
الف: کوفاکتور نقش یک واسطه را برای پیوند مولکولهای آنزیم با سوبسترا بر عهدهدارند.
ب: برخی از کوفاکتورها خود در عمل کاتالیز شرکت می نمایند. از این جمله میتوان فلز آهن را در آنزیم کاتالاز مثال زد.
کوفاکتورهایی که از یک مولکول ترکیب آلی تشکیل یافتهاند، اینگونه کوفاکتورها را کو آنزیم مینامند.
کوفاکتورها اغلب با پیوند ضعیف و کم انرژی به قسمت پروتئینی آنزیم اتصال یافته است، ولی در بعضی موارد مشاهده میشود که این اتصال توسط پیوندهای کووالان انجامگرفته است. اینگونه کوآنزیمها را گروه پروستتیک مینامند. بیشتر کوآنزیمها از مشتقات ویتامینهای محلول در آب میباشند. کوآنزیمها عموما در مقابل حرارت مقاوم میباشند، درحالیکه قسمت پروتئینی (آپوآنزیم) در برابر حرارت ناپایدار و آسیبپذیر است.
۱-۲-۳-۱ اصول کلی واکنشهای آنزیمی
الف: در واکنشهای بیوشیمیایی که توسط آنزیم کاتالیز می گردند، معمول سه عامل شرکت دارند:
سوبسترا یا جسمی که تحت تاثیرداشته آنزیم قرار میگیرد.
آنزیم یا ترکیبی که از آنزیم و کوفاکتور که بر روی سوبسترا اثر نموده و واکنش را کاتالیز میکند.
محصول که در جریان واکنش تولید میشود.
ب: آنزیم در طی واکنش به مصرف نرسیده و بدون هیچگونه تغییری در خاتمه واکنش آزاد میگردد.
۱-۲-۳-۲ سوپراکساید دیسموتاز
سوپراکسایددیسموتاز ها خط اول دفاعی گیاهان علیه رادیکالهای آزاد اکسیژن در درون سلول میباشند (افشر، ۲۰۰۲). سوپراکسایددیسموتاز آنزیمی متعلق به خانواده متالوآنزیمها است که رادیکالهای سوپراکساید را به پراکسیدهیدروژن و مولکول اکسیژن تبدیل میکند. این واکنش توسط کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز ادامه مییابد یعنی آنها پراکسیدهیدروژن را به آب و اکسیژن تجزیه می نمایند و بدین ترتیب از تجمع رادیکالهای سوپراکساید که برای سلولها بسیار مخرب هستند، جلوگیری می نمایند (بیسر و همکاران،۱۹۹۱، بلوخینا و همکاران، ۲۰۰۳). سوپراکساید در هرجایی که چرخه انتقال الکترون وجود داشته باشد تولید میشود، بنابراین برانگیختگی اکسیژن میتواند در هر بخشی از سلول ازجمله میتوکندری، کلروپلاست، گلیاکسیزوم، پراکسی زوم، آپوپلاست و سیتوسل رخ دهد، درنتیجه نباید از وجود سوپراکساید دیسموتاز در تمام این اندامکها شگفتزده شد (افشر، ۲۰۰۲). بر اساس نتایج مطالعات آسادا و تاکاهاشی (۱۹۸۷)، غشاهای فسفولیپیدی توانایی تراوش مولکولهای O2- را ندارند، بنابراین وجود سوپراکساید دیسموتاز در محلی که مولکولهای -O2 تولید میشوند بسیار حیاتی است. افزایش بیشتر مقادیر آنزیم سوپراکساید دیسموتاز در واریتههای متحمل نخود، پنبه، گوجهفرنگی و … در مقایسه با واریتههای حساس، میتواند دلیلی برای نقش مهم این آنزیم برای مقابله با تنش خشکی باشد (میتووا وهمکاران، ۲۰۰۲). برای توجیه این مسئله، به نظر میرسد که بالاتر بودن فعالیت SOD در ارقام متحمل موجب کاهش صدمات رادیکالهای آزاد اکسیژن، کاهش پر اکسیداسیون چربی و درنتیجه افزایش شاخص پایداری غشاء (MSI) در این ارقام میگردد.
۱-۲-۳-۳ کاتالاز
آنزیم کاتالاز یک تترامر بوده و دارای گروه هم (heme) است و زیر واحدهای آن در گیاهان بین ۵۹-۵۴ کیلو دالتون وزندارند. هر مونومر دارای یک هم و NADPH میباشد. هر NADPH نیز توسط ۱۲ اسیدآمینه به سطح هر مونومر متصل و از اکسیدشدن آنزیم توسط H2O2 که سوبسترا آن است جلوگیری میکند. هم شامل پروتوفیرین و یک هسته آهنی است. کاتالاز در پراکسی زوم یوکاریوتها جایی که مسئولیت تبدیل پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن را بر عهده دارد بهوفور یافت میشود. فعالیت آنزیم کاتالاز بسیار زیاد بوده بهطوریکه یک مولکول آن میتواند میلیونها مولکول پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل کند. واکنش کاتالاز از سریعترین واکنشهای آنزیمی شناختهشده است و ثابت سرعت آن M-1Sec-1k ≈ ۱۰۷ میباشد ولی سرعت واکنش پراکسیداتیک آن کمتر بوده و سرعت آن M-1Sec-1k ≈ ۱۰۳ است. واکنش کاتالیتیک وجه تمایز کاتالاز از پر اکسیدازها است. اینکه کاتالاز با کدامیک از واکنشگرها وارد عمل شود، بستگی به غلظت هریک از آنها در محیط دارد. واکنش پراکسیداتیک تنها زمانی پیش میرود که مولکول هیدروژن دهنده در محیط وجود داشته باشد و غلظت پراکسید هیدروژن بسیار پایین (کمتر از چهار میکرومولار) باشد، در غیر این صورت واکنش کاتالیتیک غالب خواهد بود. کاتالاز دارای ۴ گروه هم پورفیرین (آهن) هست که به آنزیم امکان میدهد که با پراکسید هیدروژن واکنش نشان دهد.
۱-۲-۳-۴ آسکوربات پراکسیداز
آسکوربات پراکسیداز آنتیاکسیدانتی است که وظیفهای مشابه کاتالاز انجام میدهد با این تفاوت که از آسکوربات بهعنوان عامل احیاکننده استفاده میکند. آسکوربات پراکسیداز نقش مهمی در تنظیم میزان پراکسید هیدروژن درونسلولی دارد (وان بروسم و همکاران، ۲۰۰۱؛ شیجاکا، ۲۰۰۲). APX ها خانوادهای از آیزوزایمها با ویژگیهای متفاوت هستند. آسکوربات پراکسیدازها به چهار دسته تقسیم میشوند: استرومال (sAPX) و APX متصل به غشاء تیلاکوئیدی در کلروپلاستها (tAPX)، APX متصل به غشاء میکروبادیها (شامل گلیاکسیزوم و پراکسی زوم) (mAPX)، آسکوربات پراکسیداز سیتوسولی و سرانجام آسکوربات پراکسیداز متصل به غشاء میتوکندریایی (mitAPX).
۱-۲-۴ بررسی ژنهای واکنش دفاعی
فعالیت سلولها در همه موجودات با فعال کردن و غیر فعال کردن بیان ژنها تنظیم میشود. ژنوم موجودات یوکاریوتی دارای تعداد زیادی ژن است، ولی در هر سلول تنها بخشی از ژنها بیان میشوند که به نوع عمل سلول بستگی دارد. بیان ژن به طور مستقیم به تعداد نسخههای mRNA ژن در یک بافت گفته میشود که سطوح بیان ژن با میزان پروتئین مربوطه همبستگی مستقیمی دارد. روش قدیمی تعیین mRNA خاص استفاده از تکنیک نورترن بلات بود که به دلیل نیاز به RNA بالا در شرایطی که میزان آن محدود است کارآمد نیست.
PCR یکی از روشهای انتخابی برای تعیین اختصاصی نوع ژنهای بیانشده در مواد گیاهی است (مارتین و ریجیویکس، ۲۰۰۵). کاربرد جداسازی محصولات PCR در الکتروفورز، قابلیت آنالیز کمی نمونههای DNA را ندارد (مک کارتنی و همکاران، ۲۰۰۳). آنالیز کمی پلیتهای DNA میتواند با PCR رقابتی که در آن جفت پرایمر یکسان برای دستیابی به DNA به کار میرود، صورت گیرد. نسبت حجم دو محصول تولیدی به عنوان یک روش اندازهگیری در پلیتها به کار میروند (نیچلسون و همکاران، ۱۹۹۸)؛ بنابراین PCR رقابتی به علت روش زمانبر و عملکرد محدود آن هیچگاه به عنوان یک روش روتین نیست.
ارزیابیهای بر پایه الکتروفورز با ژل آگارز باعث ایجاد محدودیت در عملکرد میشود؛ بنابراین، کاربرد مطالعات اپیدمیولوژی که عمدتا شامل تعداد زیادی از نمونهها میشود، محدود شده است. مشکل PCR سنتی بوسیله روشهای Real-Time PCR کاهش یافته است که یک روش جدید برای تعین کمیت صحیح و نمایش میزان بیان ژنها است که روشی سریعتر و قابل اعتمادتر نسبت به روشهای قبلی است (مک کارتنی و همکاران، ۲۰۰۳). Real-Time PCR حساسیت PCR متداول را با تولید سیگنال فلورسنت به صورت اختصاصی ترکیب کرده و امکان تجزیه در زمان واقعی را در واکنشهای سینتتیک و کمیت سنجی DNA اختصاصی را فراهم میسازد. سیگنال فلورسنت نیاز به مراحل بعدی مانند الکتروفورز و رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید را بر طرف میکند و به صورت معنیداری زمان و کار کمتری برای آنالیزها نیاز است و بازده PCR را به صورت عمدهای افزایش میدهد و آن را برای مقیاسهای بزرگتر در آنالیزها مناسب میسازد (اسچنا و همکاران، ۲۰۰۴).
qRT-PCR روش واکنش زنجیرهای پلیمراز روش مناسبی برای مطالعه تظاهر ژنها با دقت و حساسیت زیاد و اطمینان بالا به شمار میرود. این روش بیشترین حسایت را در بین روشهای کمی دارد و میتوان از آن برای مقایسه سطوح mRNA برای تعیین الگوی تظاهر ژن بین گونههای خویشاوند و تجزیه ساختار RNA استفاده نمود (بوستین، ۲۰۰۰).
۱-۲-۵ بیان ژن
۱-۲-۵-۱ اندازه گیری بیان ژن
اندازهگیری بیان ژن با روشهای قدیمی مشکلات مختلفی دارد. در این روشها ارزیابی واکنش زنجیر پلیمراز با بهره گرفتن از ژل آگارز و در آخرین مرحله صورت میگیرد که زمانبر و به دلیل تمایز این روش براساس اندازه از دقت زیادی برخوردار نیست. با بهره گرفتن از ژل آگارز تفاوت ۱۰ برابر مشخص میشود در صورتی که با این روش تفاوت ۲ برابر میزان نوکلئیک مشخص میگردد.
در این روش غلظت نسبی DNA در فاز نمایی واکنش با رسم نمودار لگاریتمی میزان فلورسنت در مقابل تعداد چرخه نشان داده میشود (نمایش فاز نمایی با یک خط راست). یک آستانه برای میزان فلورسنت در نظر گرفته میشود. در چرخه واکنش، محلی که فلورسنت به حد آستانه میرسد، آستانه چرخه Ct نامیده میشود. از آنجائی که مقدار DNA دو برابر میشود، مقدار نسبی DNA قابل محاسبه است، برای مثال نمونهای که چرخه آن سه سیکل زودتر از بقیه به Ct خود میرسد، هشت بار نمونه بیشتری دارد. سپس مقدار DNA یا RNA با مقایسه نتایج با منحنی استاندارد که با انجام qRT-PCR در محلول رقیق از مقدار مشخص از DNA یا RNA ایجاد شده، قابل تعین است. همانطور که در بالا آمده است، برای تعین دقیق میزان تظاهر ژن، مقدار RNA تعیین شده از ژن هدف بر مقدار RNA یک ژن خانهدار در نمونه مشابه تقسیم میگردد تا برای اعمال تغییرات احتمالی در مقدار و کیفیت RNA در بین نمونههای مختلف نرمال گردد. این نرمال شدن مقایسه دقیق بیان ژن هدف را بین نمونههای مختلف امکانپذیر میسازد به این علت که بیان ژن مرجع در نمونههای مختلف خیلی مشابه است، انتخاب ژن مرجع به دلیل اینکه تنها ژنهای کمی وجود دارند که در دامنهی مختلفی از شرایط یا بافتها سطح بیان برابری دارند، مشکل است (نولان و همکاران، ۲۰۰۶).
۱-۲-۵-۲ آنالیز بیان ژن و روش های بررسی بیان ژن مبتنی بر PCR
فنوتیپهای مختلف تک سلولیها و پرسلولیها ناشی از تفاوت بیان ژنها و اللهاست که ژنوم هر گونه را تشکیل میدهند. بیشتر سلولهای مختلف یک موجود زنده مثل سلولهای عصبی، کبد، استخوان و خون نیز تفاوتهای فنوتیپی بارزی نشان میدهند. این تفاوت نتیجه تفاوت توالی دی. ان. ا. ژنومی نیست، بلکه به علت بیات متفاوت ژنهای خاص در هر سلول طی رشد است. در بیولوژِی نوین، آنالیز صحیح بیان ژن، نه تنها برای درک بهتر ما از عمل ژن و پروتئین، بلکه برای جستجوی رونوشتهایی با سطح بیان پایین روز به روز اهمیت بیشتری پیدا میکند. این رونوشتها با مقادیر بسیار کم در زیست فناوری یا تشخیص بیماریها کاربرد دارند. نورترن بلات، هیبریداسیون در محل یا آزمونهای حفاظت از RNase برای سالهای زیادی روشهای مرسوم آنالیز بیان ژن بودهاند. با اینکه این روشها هنوز زیاد استفاده میشوند، اغلب وقتگیر و نسبتا غیرحساساند و جستجوی رونوشتهای کمیاب با آنها مشکل یا غیر ممکن است. PCR به عنوان ابزاری برای آنالیز الگوهای بیان ژن و جستجوی رونوشتهای کمیاب، حساسیت آنالیز بیان ژن را زیاد کرده است. با بهره گرفتن از رنگهای فلورسنتی، آنالیز لحظه به لحظه تجمع محصولات چندگانه ممکن است که اطلاعات پرمایهتری در مورد سطوح نسبی رونوشتهای ژنی مختلف ارائه دهد.
دانلود پروژه های پژوهشی در رابطه با بررسی اثر تنش خشکی روی بیان برخی از ژنهای ...