۱-۸-۱ متابولیت های اسفنج دریایی با خواص ضد پاتوژنی
تحقیقات نشان داده استعصاره ی اسفنجHalicloa exigusعلیه قارچ هایAspergillus, Candida albicans , Cryptococcus neofromans, fumigatesوCandida
parapsiloisاثر ضد قارچی، عصاره ی اسفنج هایAmphimedon viridi وNeopetrosia sp.اثرضد لشمانیایی ،عصاره ی اسفنج هایChondrosia reticulate ,Halichondria sp.
وAxinyssa sp. خاصیت ضد سل،عصاره ی اسفنج Phakelliaventilabrum خاصیت ضد مالاریایی، عصاره ی اسفنجTopsentia sp.خاصیت قوی همولیتیک کننده اریتروسیت های خون تازه ی خوک و عصاره ی اسفنج Myrmekioderma styxخاصیت بارز هموگلوتینه کردن را داشته اند (Dhinakaran and Lipton,2012).
״Bugniو همکاران در سال ۲۰۰۴،همچنین Lu و همکاران در سال ۲۰۰۷از اسفنج Acanthella cavernosa در فلیپین یک سریKalihinol استخراج کردند که توانایی مهار باکتری سنتز کننده ی فولات (فولیک اسید) را دارند.( Joseph andSujatha, 2011)״
۱-۸-۲ متابولیت های اسفنج دریایی با خواص ضد سرطانی
در سازمان ملی سرطان NCI (National Standards Institute)بیش از ۹۰ ترکیب سیتوتوکسیک ضد تومور جدیدجهت بررسی اثر مثبت در بخش سلول های توموری بر حیوانات آزمایشگاهی مورد توجه قرار گرفت. مشکل بزرگ تولید داروها از موجودات دریایی جداسازی و خالص سازی خیلی اندک ماده زیست فعال طبیعی می باشد (Joseph and .Sujatha, 2011).
״ TuckerوAnil در سال۲۰۰۰ به اثر ضدباکتری باکتری های همزیست اسفنج Ircinia ramoseاشارهداشتند که اهمیت ضد توموری دارد و در مدل های پیش بالینی بر دامنه عظیم سل لاین ها موثر بوده است (Joseph and Sujatha, 2011)״.
۱-۸-۳ متابولیت های اسفنج دریایی با خواص آنتی بیوتیکی
اسفنج دریاییAplysina caissara متعلق به راسته یVerongidaدارای ترکیباتFistyralin-3 و ۱۱-hydoxyaerothioninمی باشد که علیهE.coli و P.aeruginosa فعالیت متوسط آنتی بیوتیکی دارند.اسفنجIrciniasp. دارای مولکول هایی است که از نظر زیستی فعال هستند و نشان دهنده ویژگی های آنتی بیوتیکی قوی،ضد درد و ضد التهابی می باشند (Dhinakaran and Lipton,2012).
اسفنجAplysina cavernicola دارای ترکیباتAeroplysinin , aerthionin , و دیگر مشتقات دی برمو و دی کلروتیروزین است که دارای برخی فعالیت آنتی بیوتیکی علیهB.subtilis , P. vulgaris می باشد.از اسفنجSuberites domuncula یک لکتینKDa 27 خالص سازی شد که اثر ضد باکتری علیهE.coli و Staphlococcus aureusرا نشان داده است (Dhinakaran and Lipton,2012).
۱-۹ ترکیبات فعال زیستی اسفنج دریایی در مرحله کاربردبالینی
پتانسیل برخی داروهای زیستی از تولیدات طبیعی مورد توجه بخش داروشناسی قرار گرفته اند که کاربرد های متنوع دارند.برای مثال نوکلوئید آرابینوز از اسفنج Cryptotethya crypta اثرضد ویروسی و ضدسرطانی داردو کاربرد بالینی نیز پیداکرده است. از اسفنج Luffariella variabilis مانوآلدئیدی بدست آمده که خاصیت ضدالتهابیدارد (Joseph and Sujatha, .2011).

بسیاری داروهای دریایی از تولیدات طبیعی بی مهرگان دریایی، بطور غالب ازاسفنج ها در مراحل پایانی آزمایش های بالینی یا در مرحله ی تجاری شدن می باشند برخی از این داروها)Ara-A ضد ویروس(،Ara-C )ضد سرطان(، مونوآلدئید(مهار کننده ی فسفولیپازA2 ) وارد بازار شده اند و IPL51602 (ضدالتهابی)،KRN7000(ضدسرطان)، LAF389(ضدسرطان)، HTI286(ضدسرطان)،Discodermlide (ضدسرطان) در مراحل آزمایش بالینی قرار گرفته اند(Joseph and Sujatha, 2011).
۱-۱۰اهمیت مسئله
با توجه به افزایش مقاومت پاتوژن های بیماری زای انسانی امروزه تحقیقات در زمینه ی اثرات عصاره ی اسفنج های دریایی در زمینه ضد سرطانی،ضدمالاریایی،ضد التهابی،ضدمیکروبی،ضد قارچی،ضدسل ،ضدایدز و … در سراسر جهان به منظور استخراج مواد زیست فعال به عنوان داروی هایی با منشا زیستی ضروری می باشد.
۱-۱۱اهداف تحقیق:

• • بررسی پتانسیل ترکیب زیست فعال اسفنج های خلیج فارس

• • استخراج عصاره ضد میکروبی از اسفنج های خلیج فارس

• • بررسی اثر عصاره استخراج شده بر پاتوژن های انسانی

• • سنجش حداقل غلظت مهار کنندگیMIC(Minimum inhibitory concentration) و حداقل غلظت باکتریایی MIB(Minimum concentration bacteria )

فصل دوم
مروری بر پیشینه ی پژوهش
۲-۱خاصیت ضد میکروبی باکتری های همزیست اسفنج دریایی
Newbold و همکاران در سال ۱۹۹۹عصاره ۳۳ گونه اسفنج دریایی را جهت بررسی اثر ضد میکروبی آنها علیه میکروب های دریایی استخراج کرده که ۴۸% از آنها حداقل بر یک باکتری اثر مهار کنندگی رشد را نشان دادند(Newbold et al., 1999).
۲-۲ خاصیت ضد باکتری عصاره اسفنج دریایی
Said و همکاران در سال ۲۰۱۰ از میان ۱۸ عصاره اسفنج دریایی بررسی شده جهت سنجش اثر ضد میکروبی، ۱۲عصاره(۶۶٫۷%) نشان دهنده فعالیت ضد میکروبی بر یک یا چند میکروب از درجه مقیاس تاثیر ضعیف تا قوی بودند.وی قطر ناحیه مهارکنندگی ۶ تا ۱۰ میلی متر را ضعیف و قطر ۱۱تا ۲۰ میلی متر را خوب و بیشتر از ۲۰ میلی متر را قوی در نظر گرفت. طبق مشاهدات وی عصاره ی اتیل استات از اسفنج گونه هایHalichondrida sp و Oceanopia spبر مخمر Candidaalbicans اثر مهار کنندگی خوب را نشان دادند .
عصاره اتیل استات اسفنج گونه های .Oceanopia sp،Agelas mauritaniaHymeneciadon sp. وعصاره ی هگزانTedaniasp.بر قارچCryptococcus neoformans نشان دهنده اثر خوب تا قوی می باشد .
عصاره یHalichondria spبر باکتری Bacillus anthracisاثر قوی و برProteus mirabilis وStaphlococcus aureusاثر خوب را نشان داد. عصاره اتیل استات Oceanopia sp. بر Bacillus anthracis ، Proteus Mirabilis، S. aureus وShigella dysentriae اثر مهار کنندگی خوب را نشان داد.در میان ۱۸ عصاره مطالعه شده ۶عصاره (۳۳٫۳%) هیچ اثر ضد باکتری یا ضد قارچی نداشته اند و شامل عصاره اتیل استات اسفنج دو گونه ی .Cliona sp،یک گونه ازHalichondria sp.،یک گونه ازPseudoceratina clavata و یک گونه از Suberites sp.و همچنین عصاره ی هگزانی .Myxillina sp می باشند(Said et al., 2010).
۲-۳ عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Haliclona sp.
Darah وهمکاران در سال ۲۰۱۱ نمونه ی اسفنجHaliclona sp.از سواحل مالزی را خشک کرده و عصاره متانولی آن را تهیه نموده بر کشت های میکروبی باکتری گرم مثبتMRSA (استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین)، گرم منفی، قارچ هاو مخمرهایC.albicans وutillis^[3]C.آزمایش کردند. عصاره متانولی برB.cereus, B.,A.anitratus ,ErwiniaspB.subtilis,spizizenii.و MRSA موثر بوده در حالی قارچ ها و مخمر های دیگر هیج نوع حساسیت به این عصاره نداشته اند.
۲-۴ عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Sigmadocia pumila
ایساک و لیپتون در سال ۲۰۱۲ با تهیه عصاره متانولیاسفنجSigmadocia pumila سواحل هند و سنجش آن بر میکروب های بیماری زای انسان از جمله باکتری های گرم منفیE.coli ,K pneumonia,P. putida ,S. liquefaciene اثر مهار کنندگی رشد را نشان داد در حالی که بر باکتری های گرم مثبت جز S. aureus بر سویه های دیگر بی اثر بود .(Isaac and Lipton, 2012)
۲-۵ عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Zygomycale sp.
Manjusha و همکاران (۲۰۱۲) عصاره متانولی اسفنج دریاییZygomycale sp. تهیه و بر چند سویه باکتری و قارچ بیماری زای انسانی بررسی کرده اند، این عصاره اثر ضدباکتری علیه باسیلوس مگاتوریوم،کلیبسلا پنومونیه ،استرپتوکوکوس پیوژنز و اثر ضد قارچی علیه Rhizomucor miehei، کاندیدا آلبیکنس،آسپیرژیلوس نیجر و آسپیرژیلوسفمگاتوس را نشان داد،عصاره ای اسفنج بر باکتری گرم مثبت ۷۷%، گرم منفی۳۵% و بر مخمر %۳۲ اثر مهار کنندگی دارد،با تجزیه و تحلیل عصاره بوسیله کروموتوگرافی GC-MS طیف گسترده ای از مواد شیمیایی با عملکرد متنوع در میان مواد زیست فعال شناسایی شده که تنوع پلی کیتیدها،آلکالوئیدها ،اسیدهای چرب ، پپتیدها و ترپنوئیدها بیشتر بوده که دارای اثر ضدمیکروبی، ضد سرطانی و ضد توموری می باشند.
جدول ۲-۱ترکیبات فعال زیستی و در صد فراوانی آن هادرعصارهاسفنج در یایی Zygomycale sp.
(Manjusha et.al.,2012)
۲-۶ بررسی اثر ضد قارچی چهارنوع عصاره از نه گونه اسفنج دریایی
Palpandi و همکاران )۲۰۱۳( نه گونه اسفنج دریایی از آبهای ساحلی جنوب شرقی هند را جهت بررسی اثر ضد قارچی عصاره آنها جمع آوری کرده سپس عصاره هایی با حلال های متفاوت از جمله عصاره اتانولی ، متانولی، استون و کلروفرمی به دست آوردند و علیه ۹ سویه قارچ بیماریزا انسانی بررسیکرده،نتیجه بررسی آنها ۴گونه اسفنج از رده یKeratosida(Psammaplysilla, spongia officinalis Var.ceylonesis, Hyattella cribriformis,purpurea, Dysiclea fragilis) نسبت به اثر ضد قارچی عصاره کلروفرمی می توان در تهیه داروهای منحصر به فرد از آنها استفاده کرد، این رده اسفنج بر قارچ هایC.albicans, A.niger, A.fumigatus, A.flavus موثربوده اند. Palpandi وهمکاران ذکر کردند که عصاره های متانولی و استونی در این تحقیق اثر ضد قارچی ندارند.
۲-۷ خواص ضد باکتریایی عصاره اسفنج Axinella sinoxea از جزیره لارک خلیج فارس
در تحقیق ناظمی و همکاران در سال ۱۳۹۰ عصاره ها یی از اسفنج دریاییAxinella sinoxeaدر غلظت های متفاوتی مورد آزمایش مهار کنندگی رشد باکتریایی قرار گرفت که حداقل غلظت مهار رشد عصاره دی اتیل اتری برای E.coli برابر۱۰ میلی گرم بر میلی لیتر و عصاره متانولی ۴۰ میلی گرم بر میلی لیتر می باشد و عصاره آبی بی اثر بود. عصاره متانولی ،دی اتیل اتری و آبی بر باکتری aeruginosaP. بی اثر بوده و توانایی مهار رشد باکتری را نداشته اند حداقل غلظت مهار رشد باکتری عصاره دی اتیل اتری بر باکتری B.subtilisبرابر ۲۰ و عصاره متانولی ۴۰ میلی گرم بر میلی لیتر گزارش شدعصاره آبی بر این باکتری نیز بی اثر است و حداقل غلظت مهار رشد عصاره دی اتیل اتر بر باکتری S.aureus برابر ۰۷۵/۰و عصاره متانولی ۱۰ میلی گرم بر میلی لیتر و عصاره آبی بی تاثیر گزارش شد.
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱نمونه برداری
در مهر ماه ۱۳۹۳نمونه برداری یک گونه اسفنج دریایی با روش SCUBA از اعماق ۱۵ تا ۲۰ متری جزیره هرمز انجام شد(تصویر شماره۳-۱). طبق گفته غواصان این اسفنج بر سازه کشتی قدیمی غرق شدهقرار داشت(تصویر شماره۳-۲).نمونه هادر محل با آب دریا شسته شده تا رسوبات و گل ولای آنها تمیز شود سپس مقداری از نمونه ها درالکل ۱۰۰% (Palpandi et al., 2013)و مقداری نیز در هوای اتاق و دور از تابش نور مستقیم خورشید جهت خشک شدن قرار گرفتندDarah et al., 2011)( بخشی از نمونه در ازت مایع به آزمایشگاه منتقل شدند(Zeng et al.,2013 ).
تصویر ۳-۱ محل نمونه برداری
در تصویر فوق محل نمونه برداری با نشانک قرمز رنگنشان داده شده است.
تصویر۳-۲ اسفنج دریاییCallyslpongia sp. از جزیره هرمز خلیج فارس
۳-۲ تهیه عصاره اسفنج دریایی
۳-۲-۱ تهیه عصاره اسفنج خشک شده
نمونه اسفنج خشک شده را با اسکالپل به قطعات ریز درآورده در ظرف شیشه ای درب دار ریخته و نسبت حجم۱ : ۱ از حلال ها را روی آن ریخته (حجم ۲۰میلی لیتر متانول و ۲۰ میلی لیتر دی کلرومتان ) درب بطری را محکم بسته و به مدت ۲۴ ساعت در محلی تاریک و دور از گرما قرار دادهDarah et al., 2011)(،بعد از۲۴ ساعت محلول یک فاز شیری رنگ در وسط و دو فاز کاملا شفاف بالا و پایین آنایجاد کرده(تصویرشماره ۳-۳).بطری را چند مرتبه به آرامی هم زده سپس قطعات اسفنج را فشرده از بطری خارج کرده و جهت حذف رسوبات اضافی محلول را با استفاده کاغذ صافی واتمن شماره ۱ فیلتر کرده حلال اضافیمحلول بدست آمده (تصویر شماره ۳-۴)را با بهره گرفتن از دستگاه روتاری Heidolph مدل Laboreta 4011digital (تصویر شماره ۳-۵) با تنظیم دمای ۴۰ درجه سانتی گراد، چرخش ۱۰۰ دور در دقیقه و ایجاد شرایط خلاء حذف کرده، حجم نهایی عصاره ۱۵میلی لیتر بدست آمد با حرف لاتین D نام گذاری شده(تصویر شماره ۳-۶) بعد از رسیدن دمای عصاره به دمای محیط در دمای ۴ درجه سانتی گراد جهت آزمایشات بعدی نگهداری شد.