حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر PH=7.8
۳-۱۸ بردفورد
برای سنجش غلظت پروتئین از روش بردفورد استفاده گردید.

از نمونه BSA استوک mg/ml10 درست شد از این استوک با مقادیر زیر رقت سازی گردید:
(۱۰۰/۵و۱۰۰/۱۰و۱۰۰/۱۵و۱۰۰/۲۰و۱۰۰/۳۰و۱۰۰/۴۰و۱۰۰/۵۰و۱۰۰/۶۰) میکروگرم بر میکرولیتر.
سپس ۱۰۰ میکرولیتر از هر کدام از نمونه های رقت سازی شدهBSA در داخل ۵/۲ میلی لیتر از معرف اضافه شد. سپس با دستگاه اسپکتوفتومتر ۵۹۵ OD= خوانده شد و با اینها منحنی استاندارد رسم گردید. سپس ۱۰۰ میکرو لیتر از نمونه پروتئینی خالص سازی شده جدا و به ۵/۲ میلی لیتر از معرف اضافه شد. سپس باید ۵تا ۱۰ دقیقه داخل دمای اتاق بماند. بعد از آن ۵۹۵ OD= خوانده شد.سپس عددهای بدست امده را در معادله منحنی استاندارد جایگزین کرده و غلظت پروتئین مورد نظر سنجیده شد.
۳-۱۸-۱ تهیه معرف برد فورد
همه ی مواد اشاره شده در جدول (۳-۴ ) مخلوط و به آرامی هم زده و با آب مقطر به حجم ۱ لیتر رسانده شد سپس به مدت سی دقیقه الی یک ساعت روی شیکر انکوباتور قرار گرفت تا کاملا با هم مخلوط شوند سپس رنگ برداشته و صاف گردید.
جدول(۳-۴ )

اسید فسفریک %۸۵
اتانول %۹۰
Comacy blue G250

ml100
ml50
mg100

۳-۱۹- جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس
جداسازی LPS از سویه ی صاف بروسلا ملیتنسیس انجام گردید.ابتدا در محیط مخصوص بروسلا آگار از باکتری بروسلا ملیتنسیس کشت خطی تهیه شد و بعد به مدت سه روز انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد انجام گرفت تا باکتری رشد کند. البته باکتری در۷/۶PH= رشد می کند. سپس در هر کدام از دو ارلن CC1000 به میزان CC400 محیط مخصوص بروسلا براث ریخته شد. بایستی محیط ها استریل و۷/۶ph= باشد. سپس چندین کلنی تازه از باکتری به هر کدام از ارلن ها تلقیح شد و به مدت سه روز داخل شیکر انکوباتور ۳۷ درجه قرار گرفت تا باکتری کاملا رشد کرده و محیط ها کدر شوند.
سپس محیط ها به مدت ده دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد و سلولها برای جدا کردن lps نگهداری شد. وزن سلولهای جدا شده بایستی۵ گرم باشد.
۳-۱۹-۱پروتکل جداسازی lps
روش استخراج LPS
۱)
- تهیه ۵۰۰میلی­گرم وزن خشک باکتری معادل ۵گرم وزن تر باکتری(به این صورت، ابتدا کلنی باکتری به ۸۰۰ میلی لیتر محیط براث استریل تلقیح شد.)
- سپس به مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد بر روی شیکر انکوباتور در سرعت rpm180 قرار گرفت.
- محیط کشت رشد­ یافته به یک لوله فالکون ۵۰میلی لیتر(Extragene, USA)تمیز انتقال داده شد و در سرعتrpm 4000 به مدت ده دقیقه سانتریفیوژ گردید(رسوب گیری).
- محلول رویی دور ریخته شد و مرحله قبل مجددا تکرار گردید تا زمانی که تمام ۸۰۰ میلی لیتر رسوب گیری شود. قبل از رسوب گیری فالکون خالی را وزن نموده و بعد از رسوب گیری دوباره این کار انجام شد تا وزن تر باکتری محاسبه شود.
۱۵میلی­لیتر از محلول شماره ۱ به ۵گرم وزن تر باکتری اضافه شد سپس با دست ضربه زده شد تا زمانی که حل شود (ورتکس میکس)
به منظور حل شدن بهتر و لیز، در بن ماری (دمایC ˚ ۶۵) به مدت ۷ دقیقه قرار داده تا خوب هموژن شود.
۲)
اضافه نمودن ۱میلی­لیتر پروتئیناز kاز استوک g/mlµ۱۰۰ (استوک اولیه mg/ml20 بود که از این دوباره یک استوک g/mlµ۱۰۰ تهیه شد که معادل ۵میکرولیتر از استوک اولیه در ۱۰۰۰میکرولیتر آب است).قرار دادن در بن ماری (دمایC ˚ ۶۵) به مدت بیش از یک ساعت(۷۰ دقیقه قرار دادیم).سپس محلول حاصل در دمایC ˚ ۳۷ به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت.(انکوبه عادی احتیاجی به شیکر ندارد).
۳)
محلول حاصل از انکوبه خارج گردید و به آن ۲میلی­لیتر NaCH3COO,(نمک۳مولار) اضافه شد سپس ورتکس میکس صورت گرفت(انقدر ضربه زده تا نمک کاملا حل شود).نمک باعث تسهیل رسوب گذاری lps با اتانل شد.
سپس ۴۰ میلی­لیتر اتانول ۹۶% سرد اضافه و چند بار به آرامی اینورت شد.
در فریزر۲۰-درجه به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت.
به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ با سرعت rpm4000 انجام شد.
محلول رویی دور ریخته و رسوب نگهداری شد.
۴)
۹ میلی­لیتر dH2O و۱میلی­لیتر(نمک۳مولار NaCH3COO) به رسوب اضافه شد سپس چند بار با دست ضربه زده شد(vortex)تا زمانی که کاملا حل شود.
۲۰میلی­لیتر اتانول سرد اضافه شد و چند بار به آرامی اینورت گردید.
در فریز۲۰- درجه به مدت ۲۴ ساعت نگهداری شد.
به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ گردید.